基因治疗已经布局到了以阿尔兹海默病为代表的神经退行性疾病领域丨医麦新观察

今天是2018年8月7日

农历六月二十六

医麦客：神经退行性疾病治疗新方向

2018年8月7日/医麦客 eMedClub/--神经退行性病症（ND）为各种所引起的中枢神经系统（CNS）的异常削弱情况的总称，几乎所有形式的ND之间的一个共同点是严重缺乏可行的治疗方案，现有疗法的局限性导致大家对新型疗法、基于设备的治疗、物理治疗和外科手术方案的更大兴趣。

近几十年来，基因组水平的治疗形式引起了人们的极大兴趣，新的CRISPR/Cas9基因编辑工具由于有效性、安全性和灵活性而不断被探索。目前，CRISPR技术正在开发用于直接治疗患者，相关临床试验已经在国内开始进行，并将很快在美国展开。大多数其它用于神经变性疾病的基因疗法已经达到了早期临床试验，但使用CRISPR技术来治疗神经退行性疾病仍处于早期临床前阶段。

CRISPR/Cas9已用于在神经元内进行插入和缺失突变，从而在体内中产生稳定的基因敲除，这不仅展示了空间和时间上控制CNS中的基因表达的能力，还表现出对改善ND病理学中起关键作用的表观遗传方面的突破。

另外，在各种形式的治疗递送载体（例如合成纳米颗粒和脂质体载体）中，病毒通过在体内拥有更高的基因传递性能，载体脱颖而出。而非病毒递送工具在很大程度上被认为不足以用于治疗慢性神经退行性疾病，因为它们仅限于对基因表达形成瞬时修饰的潜在影响。

病毒载体可确定基因编辑的组织特异性/细胞类型特异性以及具有通过脑脊液或血流局部进入大脑的能力，使其成为在CNS中使用CRISPR/Cas9等遗传工具的强有力的递送技术，已在研究模型中表现出显著的治疗潜力。

为此，小编在下文重点介绍了联合病毒载体与CRISPR/Cas9在治疗神经退行性疾病的最新进展，其中涉及的两种主要类型的载体是慢病毒载体和腺相关病毒（AAV）载体。

阿尔兹海默症（AD）

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种进行性的神经退行性疾病，临床上表现为记忆和认知功能障碍，语言和行为能力缺失，患者后期表现出严重的失忆症和运动功能减弱，最终导致死亡。

随着疾病进程，AD患者连原先最亲近的人也记不起来（图片来源：Texas Rock Gym）

β淀粉样蛋白是大脑中淀粉样斑块的主要成分，而阿尔兹海默症患者大脑中的淀粉样斑块积累能够诱发患者脑细胞死亡。这也开启了基因治疗的有效策略，例如具有病毒载体的CRISPR/Cas9，以改变异常蛋白质的产生，从而限制异常蛋白质的积累。许多AD遗传易感因素，如载脂蛋白E（APOE）和早老素（PSEN），已被归类为AD发展的关键参与组分，也为CRISPR/Cas9系统开辟了潜在靶点。

今年4月，瑞典乌普萨拉大学的Martin Ingelsson及其同事发表了首例使用CRISPR/Cas9纠正患者细胞和小鼠淀粉样蛋白前体蛋白的瑞典型突变（APPswe），治疗早发性常染色体显性遗传AD（ADAD）。

他们敲除了突变的APPswe以减少患者细胞Aβ的产生，同时使野生型等位基因保持完整。使用相同的策略，他们还修改了携带人APPswe等位基因的转基因小鼠的基因组，但尚不清楚是否会影响AD病理。该研究成果表明：早发性AD病例可能受益于APPswe的破坏。

此外，基于AD的诱导多能干细胞（iPSC）疾病模型，哥本哈根大学与西奈山伊坎医学院的两项研究证明：利用CRISPR/Cas9纠正患者来源的iPSC中的PSEN1和PSEN2家族性突变，可以实现电生理学和β淀粉样蛋白（Aβ）分泌的正常化。

亨廷顿氏病（HD）

亨廷顿氏病（Huntington's disease, HD）是一种迟发性神经退行性遗传病，患者的发病年龄一般为30～50岁，主要病因是亨廷顿基因（HTT）异常，从而造成代谢产物亨廷顿蛋白（Htt）异常。

这些异常蛋白质积聚成块，主要侵害基底节和大脑皮质，具有高度的区域选择性。基底节运动通路受损引发运动过度，即HD的主要临床症状——舞蹈样动作；大脑皮层受损导致患者认知功能障碍，晚期多见痴呆。

亨廷顿氏病的舞蹈症症状（图片来源：curejoy）

HD的患病率在不同人群中变异很大，在美国，HD患病率为万分之一，患者需要接受全天候护理，生活质量和寿命都被大大降低。最近研究显示，中国/日本的HD患病率为100万分之4。目前，已有的疗法都只能缓解HD的症状，还没有一款改变HD进程的疗法获得FDA的批准。

与AD类似，HD中引起毒性的异常蛋白质特征，开启了使用CRISPR/Cas9与病毒载体修饰异常蛋白质产生的类似策略。

去年1月，来自费城儿童医院的Monteys等人的一项研究，通过AAV1载体递送单侧核苷酸多态性（SNP）依赖的原型间隔区相邻基序（PAM）靶向HTT外显子-1的侧翼，将Cas9蛋白连接至突变型HTT（mHTT）等位基因，同时避免影响正常的等位基因。结果表明，这种基于SNP指导机制的sgRNA/SpCas9复合物的递送有效地将HD小鼠的HTT表达降低高达40％。

去年6月，埃默里大学（美国亚特兰大）的一组研究表明，利用AAV病毒载体递送CRISPR/Cas9介导的失活，诱导小鼠内源性mHTT表达的永久性抑制。科学家们注意到，几周后，亨廷顿小鼠模型原本聚集在脑内的毒性蛋白质几乎完全消失了。更令人惊讶的是，尽管没有达到对照小鼠的水平，但小鼠的运动能力的确有所改善。这为神经退行性疾病的研究开辟了一条全新道路，研究人员表示希望能够尽开展人体试验。

今年2月，来自波兰生物有机化学研究所的研究人员在HD患者的细胞模型中测试了一种新的Cas9蛋白变体，该版本的Cas9能切割一条DNA链，而不是两条DNA，这增加了Cas9可以编辑特定DNA序列的精确度。他们使用该版本的Cas9切除重复DNA序列，从而促使引起亨廷顿氏病的基因失活，并终止毒性蛋白质的合成，并且没有观察到序列特异性的副作用。

肌萎缩侧索硬化（ALS）

肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）即为大家所知的渐冻人症，也是导致霍金在轮椅上度过晚年的疾病。这是一种慢性进行性运动神经元退化性疾病，占运动神经元病的80%，随着疾病进展患者会出现严重的肌肉萎缩，瘫痪甚至因呼吸衰竭而死亡，一般无认知、智能和感觉障碍。

霍金（图片来源：ELA）

在美国，ALS的患病率约为10万分之5，中国尚无确切的流行病学资料。ALS有家族性和散发性两种类型，患者多为男性，多数患者发病年龄为50~70岁。

目前还没有用于ALS根治性的药物，它的致病机制尚不清楚。ALS属于神经退行性疾病，此类疾病都有一个共同特征——异常蛋白质团块在大脑中积累。在ALS中，这些蛋白质团块或聚合物被认为对神经元具有致命毒性，最终导致毁灭性的疾病症状。

ALS的某些形式（约20％的遗传形式）是由超氧化物歧化酶1（SOD1）基因突变引起的，这种基因通常有助于保护细胞免受有毒自由基的侵害，这为CRISPR/Cas9作为ALS的前瞻性治疗手段取得了进展。

强有力的概念证明是发表于2017年末的一项研究，来自加州大学伯克利分校的研究人员使用Cas9切除编码SOD1蛋白的基因，并利用工程化的AAV载体穿透脊髓靶向运动神经元细胞核。

与未治疗的大鼠相比，经过治疗的大鼠的运动神经元保留率提高了约50％，疾病发作延迟了37％，生存机会增加了约25％，同时，突变SOD1蛋白的产生减少了2.5倍。目前，作者正在推进工程化AAV的设计，以进一步针对ALS模型中运动神经元周围的有害细胞。

另一项研究来自河北医科大学，研究人员向SOD1基因突变的ALS小鼠肌肉注射编码人类胰岛素样生长因子1（hIGF1）的自身互补腺相关病毒载体9（scAAV9），结果发现scAAV9-hIGF1促使ALS小鼠脊髓运动神经元丢失的显著减少以及ALS疾病发作的延迟，从而整体寿命延长。

随后，研究人员使用针对CNS的IGF1敲低的CRISPR/Cas9系统进一步验证，结果使D-氨基酸氧化酶（DAO）降低，D-氨基酸氧化酶控制D-丝氨酸水平，D-丝氨酸水平与ALS相关。这种形式的神经营养因子基因治疗具有极高潜力，因为目前FDA批准的唯一一种ALS治疗方法是利鲁唑，据报道，利鲁唑仅发挥适度的神经保护作用，仅仅几个月就能提高生存率。

病毒感染引起的神经变性

除了一些我们熟知的神经退行性疾病以外，最新的临床前实验还显示，CRISPR/Cas9的治疗作用还延伸到改善由病毒感染引起的神经变性。

丨约翰坎宁安病毒（JCV）

约翰坎宁安病毒（JCV）的致病作用被称为进行性多灶性白质脑病（PML），这是CNS中可能致命的脱髓鞘疾病。JCV作为DNA病毒的性质使其可成为CRISPR/Cas9系统的主要靶标。

丨人类免疫缺陷病毒（HIV）

HIV感染导致免疫失调与自身免疫激活相结合，导致与脑病诱导相关的神经认知障碍，这种病毒引起的主要神经系统疾病是NeuroAIDS。长期感染艾滋病病毒已经证明可以诱导显著的神经元丢失，并在一定程度上导致神经变性。

由于HIV是一种逆转录病毒，能整合到宿主细胞基因组中，它可以作为一个持续的原始病毒库来重新激活，导致该疾病通常是无法治愈的。但HIV的DNA前病毒复制中间体允许使用CRISPR/Cas9有效靶向系统，故在基因组水平上的根除策略具有治愈潜力。

丨单纯疱疹病毒（HSV）

与HIV和JCV相比，靶向HSV缺乏成功的研究，而由于它是一种DNA病毒，很可能响应于基于CRISPR/Cas9的基因治疗。此外，研究表明HSV可能是阿尔兹海默症的病因，这更加激发起了人们对此新型治疗手段的兴趣。

CRISPR治疗神经退行性疾病的策略（图片来源：Neurological Sciences）

结语

CRISPR/Cas9基因编辑工具是基因治疗和分子医学领域的一个强大的武器库，应该开展更多的研究，重点关注这种工具在神经退行性疾病领域提供的充足潜力。另外，病毒载体结合CRISPR/Cas9基因编辑提高了整体效率，为基因组水平的神经疾病的治疗提供了令人印象深刻的组合，而向临床转化前其安全性还有待进一步的验证。

随着病毒载体工程和CRISPR/Cas9基因编辑技术的进步，这种结合形式的治疗手段有望发挥强大的治疗潜力。

来源：

https://doi.org/10.1007/s10072-018-3521-0

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